Dejo un trabajito sobre cuestiones basicas de microbiologia hoy medios de cultivo:
FUNDAMENTO TEORICO.
Aunque las tendencias en microbiología clínica apuntan claramente hacia el desarrollo de métodos rápidos, independientes del crecimiento de los microorganismos, para determinar la presencia de agentes infecciosos, el aislamiento y la identificación de los patógenos viables son aún el “estándar” de oro” para el diagnóstico actual de las enfermedades infecciosas.
Medios artificiales.
El objetivo principal de preparar un medio de cultivo es proporcionar una mezcla equilibrada de todos los nutrientes requeridos, en concentraciones que permitan un buen crecimiento del microorganismo para el cual ha sido diseñado.
Es necesario disponer de una base mineral que proporcione todos los electrolitos en forma iónica, que pueden actuar como nutrientes y/o favorecedores de la actividad enzimática.
Este medio basal debe suplementarse con sustancias orgánicas que actúan como fuente de energía y/o una fuente de carbono más algún factor de crecimiento requerido. Estos suplementos variarán de acuerdo con las propiedades nutricionales particulares del organismo que se desea cultivar.
La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y peptona a la que se añadirán otros ingredientes.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licua completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados.
Estos medios pueden promover el desarrollo de microorganismos solamente si se cumplen ciertos requisitos para el crecimiento, éstos incluyen:
Temperatura de incubación.
Los microorganismos mesófilos crecen en forma óptima entre 20 y 40 ºC. Otros como los psicrófilos lo hacen a temperaturas entre 10 a 20 ºC y en los termófilos la temperatura es de 50 a 60 ºC. En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 35 ºC, y los saprófitos tienen rangos más amplios.
Condiciones adecuadas de humedad.
La presencia de agua en el medio y en la atmósfera es indispensable para el crecimiento bacteriano.
Concentración salina.
La mayoría de los organismos crece bien en medios ordinarios. Otros como las bacterias halófilas requieren altas concentraciones salinas.
pH.
La concentración de iones hidrógenos es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de las bacterias se desarrollan en medios con un pH neutro, aunque las hay que requieren medios más o menos ácidos y otras, alcalinos.
Oxígeno.
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal (aerobios). Los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental y los que son microaerófilos crecen bien si la tensión de oxígeno es inferior a la que precisan los aerobios. Ciertos organismos (p.ej., los meningococos y gonococos), crecen mejor si la PCO2 es algo superior a la del aire (capnófilos). Los anaerobios facultativos son capaces de crecer en condiciones aerobias o anaerobias.
CLASIFICACION DE MEDIOS DE CULTIVO.
Los medios de cultivo en microbiología pueden clasificarse de muchas maneras:
a) Según su estado físico
- líquidos
- sólidos
- semisólidos
b) Por su naturaleza
- naturales
- artificiales o sintéticos
- semisintéticos
c) Por su finalidad metabólica
- mínimos
- diferenciales
- enriquecidos
- selectivos
- de enriquecimiento
d) Por su uso
- pruebas bioquímicas
- recuento de bacterias
- especiales
- transporte
- medios de mantenimiento
a) Según su estado físico.
Medios líquidos: permiten el crecimiento libre de los microorganismos con distribución y características que dependerán del germen o de las necesidades del usuario, de que sea estático o esté agitado permanentemente y de su relación con la fase gaseosa (oxígeno en general) u otra.
Medios sólidos: (Agar -agarosa) permiten el crecimiento de los microorganismos en el interior o en la superficie sólida o semisólida del medio que contacta directamente con la fase gaseosa. Los medios sólidos tienen de 1,5% a 2% de agar, en tanto los semisólidos tienen de 0,3 a 0,5% de agar.
b) Por su naturaleza.
Medios naturales: son aquellos en los que todos sus componentes son sustancias biológicas de las cuales no se conoce su composición cuali ni cuantitativa.
Medios sintéticos: son aquellos de composición química conocida definida cuali y cuantitativamente.
Medios semisintéticos; son medios que contienen sustancias químicas en proporciones conocidas junto a productos de origen natural. Ej agar sangre, agar nutritivo, etc.
c) Por su finalidad metabólica.
Medios mínimos: son aquellos que presentan en su composición la base mínima de nutrientes capaz de permitir el desarrollo de microorganismos.
Son de uso frecuente para el cultivo de microorganismos poco exigentes, también sirven de base para otros medios. Su composición es muy simple: contienen cloruro de sodio, extractos de carne (fuente de vitaminas y coenzimas), peptona (proteínas parcialmente hidrolizadas) y agua. Sirven para el desarrollo, aislamiento y conservación de microorganismos. Ejemplos: Caldo nutritivo (CN), Agar nutritivo (AN),
Agar tripteína-soya (ATS).
Medios diferenciales e indicadores: son aquellos que permiten determinar características metabólicas o marcadores genéticos de microorganismos, sin inhibir sus funciones fisiológicas. En estos se incluyen diversos colorantes e indicadores de pH y otros componentes, que actúan como indicadores de las actividades enzimáticas y ayudan a identificar las bacterias aisladas. Estos medios no contienen sustancias inhibitorias.
Ejemplo: Agar-Cistina Lactosa Deficiente en Electrolitos_(CLDE): Permite la diferenciación de bacterias fermentadoras de lactosa de las no fermentadoras. La degradación del hidrato de carbono a ácido origina un viraje de color hacia el amarillo del Azul de Bromotimol. La alcalinización provoca un viraje a azul intenso.
Desarrollan Enterobacterias, Pseudomonas, Enterococos y Estafilococos.
Medios enriquecidos: son aquellos que por el agregado de algunos componentes como sangre, suero, extractos de tejidos vegetales o animales al CN, AN, ATS, proveen al medio de nutrientes adicionales, que permiten el desarrollo de bacterias exigentes. Ejemplos
Agar Sangre: para su preparación se agrega sangre al 5% a un volumen de agar base
estéril, fundido y enfriado a 50 ºC. Es adecuado para el cultivo de Neumococos, Estreptococos y otras bacterias exigentes. Es además un medio de cultivo diferencial porque pone de manifiesto la acción de una hemolisina bacteriana que permite diferenciar especies hemolíticas de otras no hemolíticas. En las primeras se observa alrededor de las colonias la formación de dos tipos de halos:
Uno transparente que denota una hemólisis total, que corresponde a las especies beta hemolíticas (Ejemplo: Estreptococos de grupo A, algunos del grupo D, etc.).
Un halo de coloración verdosa o hemólisis parcial, que corresponde a las especies alfa hemolíticas (Ejemplo: Neumococos, Estreptococos no grupo A, etc.).
A las especies no hemolíticas se las suele denominar gama hemolíticas o anhemolíticas.
En agar sangre se puede observar el clásico fenómeno de satelitismo:
En el ser humano, Haemophilus influenzae es el agente etiológico más común de meningitis bacteriana aguda en los niños. La mayoría de las especies de Haemophilus requieren para su desarrollo ciertos factores de crecimiento como el factor X (hemina) y el factor V (NAD ó NADP). El factor X es empleado por los microorganismos para elaborar citocromo y otros pigmentos respiratorios aeróbicos. El factor V actúa como receptor intermediario de hidrógeno en los mecanismos respiratorios. Casi todas las bacterias son capaces de sintetizar ambos factores, excepto algunas como Haemophilus. influenzae que no sintetizan el factor V.
El agar chocolate (que se describe a continuación) proporciona estos factores (X y V) necesarios para el crecimiento de estas especies de Haemophilus. El agar sangre tiene solamente el factor X (hemina), por lo tanto, para el crecimiento del Haemophilus influenzae es necesario el agregado del factor V.
Diversas bacterias, como el estafilococo, elaboran el factor V (NAD) como producto de su metabolismo. Si la muestra de la que se pretende aislar Haemophilus influenzae se inocula por estrías sobre una placa de agar sangre y luego con un ansa se realiza una única estría de un estafilococo hemolítico productor de factor V, atravesando el área donde se ha sembrado la muestra, luego de 18 a 24 horas de incubación, es posible observar las diminutas colonias de Haemophilus como gotas de rocío alrededor de las colonias hemolíticas de Estafilococos. Éste es el fenómeno conocido como “satelitismo”.
Agar Chocolate: en su preparación se agrega sangre al 5% a un volumen de agar base estéril, fundido y enfriado a 50 ºC, la cual se calienta luego a 80ºC, agitando (evitar espuma) hasta que aparece un color marrón. Con este calentamiento se han lisado los glóbulos rojos y liberados los dos factores: el factor X (hemina) y el factor V (NAD o NADP). El agar chocolate es un medio enriquecido ideal para el aislamiento de Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis.
Se debe tener presente que algunos medios base son considerados medios enriquecidos sin ningún otro agregado, debido al alto contenido de nutrientes que poseen. Ejemplo: Caldo Infusión Cerebro-Corazón (ICC).
Medios selectivos: si los requerimientos de un microorganismo son conocidos es posible desarrollar un conjunto de condiciones en las que su crecimiento específico sea favorecido y el de otros impedidos, permitiendo su aislamiento a partir de poblaciones mixtas aún cuando esté en menor proporción.
La adición de ciertas sustancias químicas al medio de cultivo, impide el desarrollo de algunas bacterias sin inhibir otras. Estos agentes selectivos son muy útiles para evidenciar la presencia de patógenos específicos en una muestra que contiene flora mixta, y para su posterior identificación.
Son utilizados como agentes selectivos: los colorantes: ejemplo: cristal violeta que inhibe bacterias Gram (+), verde brillante utilizado en medios altamente selectivos para
eliminar la flora acompañante, Gram (+) y Gram (-). El cloruro de sodio en altas concentraciones inhibe a casi todas las bacterias excepto las halófilas.
Otros agentes selectivos son: citrato de sodio, selenito de sodio, sales biliares (desoxicolato de sodio), etc.
También puede hacerse selectivo un medio ajustando la reacción a un pH muy elevado o muy bajo. Ej: pH 5,6 en el medio de Sabouraud (para hongos); pH 8,0-9,0 para el aislamiento de Vibrio cholerae.
Otro grupo de agentes selectivos son los antimicrobianos: vancomicina, trimetoprima, colistina, etc.
Los agentes reductores también se adicionan a los medios para hacerlos selectivos y promover el desarrollo de microorganismos anaerobios. Ejemplo: ácido ascórbico, tioglicolato de sodio, cisteína, etc.
Dentro de los medios selectivos hay variación en cuanto a su poder inhibitorio; altamente selectivo, medianamente selectivo y ligeramente selectivo, etc.
Agar EMB (agar eosina-azul de metileno): es ligeramente selectivo y utilizado para el aislamiento de bacilos entéricos. Permite también la diferenciación de Escherichia coli, Enterobacter y otros microorganismos.
Los colorantes contenidos en su fórmula inhiben a muchos microorganismos acompañantes Gram (+). El medio contiene también lactosa que es degradada por las bacterias coliformes, el ácido producido por la degradación de este azúcar y la mezcla de los colorantes eosina y azul de metileno, produce el cambio de color de los mismos y su precipitación, tiñendo las colonias. Las de E. coli, lactosa (+), aparecen negro-verdosas con brillo metálico; las de Enterobacter spp, lactosa (+) con centro violeta o pardo oscuro y periferia violeta pálido sin brillo metálico. Salmonella spp y Shigella spp, que son lactosa (-), desarrollan colonias transparentes, ámbar hasta incoloras.
Agar Mc Conkey: es similar al anterior en su poder inhibitorio y contiene una mezcla de sales biliares y cristal violeta que inhibe a microorganismos Gram (+); lactosa y rojo neutro como indicador de pH. El aumento de la acidez del medio por la acción fermentadora de las bacterias lactosa (+) produce una coloración roja en sus colonias; las bacterias no fermentadoras, lactosa (-), colonias incoloras.
Agar SS: es un medio más selectivo, utilizado para el aislamiento de Salmonella y Shigella a partir de heces, alimentos, etc. El verde brillante, las sales biliares y una elevada concentración de tiosulfato y citrato, inhiben considerablemente a la flora acompañante. Con el tiosulfato y los iones férricos se pone de manifiesto la formación de sulfuro de hidrógeno por el ennegrecimiento de las colonias, al precipitar el sulfuro de hierro. La presencia de lactosa permite diferenciar colonias rojas en las bacterias L(+), y colonias incoloras en las L(-).
Agar Manitol Salado: es utilizado para la demostración de estafilococos patógenos. La concentración extremadamente alta de cloruro de sodio (7,5%), permite el crecimiento de microorganismos tolerantes a la misma, entre los que se encuentran los del género Staphylococcus.
También contiene manitol, cuya degradación lleva a la formación de ácidos, está notablemente correlacionada con la patogenicidad y sirve para detectar la presencia de Staphylococcus aureus. La acidez produce en el medio un cambio de color (de rojo a amarillo), por viraje del indicador rojo fenol. Las colonias de S. aureus tienen un crecimiento intenso, con formación de un halo amarillo luminoso por ser organismos
manitol (+). S. epidermidis tiene un crecimiento débil casi siempre y no produce
cambio de color manitol (-).
Agar Thayer Martin: con el agregado de una mezcla liofilizada de vancomicina, colistin, trimetroprima y nistatina, más aditivos estimulantes del crecimiento, es un medio ideal para el aislamiento selectivo de gonococos y meningococos, porque inhibe la flora acompañante incluida las Neisseria saprófitas. Es un medio altamente selectivo.
Medios De Enriquecimiento: generalmente son caldos, destinados a promover el crecimiento de los microorganismos presentes. Ejemplo: CN.
Se debe tener en cuenta que los caldos también pueden clasificarse en selectivos, diferenciales, enriquecidos, etc, conforme al agregado de diferentes sustancias.
Caldos Selectivos de enriquecimiento: contienen agentes inhibidores; favorecen especialmente el crecimiento de microorganismos patógenos, que generalmente se encuentran en escaso número en las muestras. Ej: Caldo Selenito para el enriquecimiento selectivo de Salmonella y eventualmente Shigella, a partir de heces, orina, agua, alimentos, etc. El selenito inhibe el crecimiento de bacterias intestinales coliformes y enterococos, principalmente en las primeras seis horas de incubación y hasta 12 horas. Proteus y Pseudomonas no son inhibidos.
Caldos enriquecidos: el agregado de diferentes sustancias no inhibidoras como por ejemplo sangre al 5% a un caldo nutritivo transforma al medio de enriquecimiento en enriquecido.
Caldos Diferenciales: son aquellos usados para identificación bacteriana, por ejemplo los caldos de fermentación de H. de C., éstos están compuestos básicamente por un caldo nutritivo, al cual se le agrega un H. de C. (lactosa, glucosa, etc) y un indicador de pH. El cambio de color del medio base, indicará la capacidad del germen de utilizar el H. de C.
d) Por su uso.
Medios para pruebas bioquímicas: utilizados para la determinación de ciertas propiedades bioquímicas de los microorganismos que junto a otras características o marcadores genéticos, permiten su identificación (investigación de la degradación de azúcares, metabolismo proteico, metabolismo lipídico). Ej: citrato de Simmons, Agar fenilalanina.
Medios para recuentos de bacterias: se emplean para la determinación del número de bacterias contenidas en materiales tales como el agua, leche, productos lácticos. Ej: Plate Count Agar (PCA), en orina el Agar CLDE.
Medios especiales: son aquellos cuya fórmula constitutiva cumple las exigencias vitales de un determinado germen que sólo en ese medio halla las condiciones óptimas de desarrollo; ejemplo: medio Lowenstein-Jensen para micobacterias.
Medios de transporte: pueden ser líquidos o semisólidos. Mantienen viables los microorganismos durante un tiempo variable y son utilizados para la remisión de las muestras al laboratorio.
Cada uno de ellos trae especificaciones en cuanto a su preparación, tiempo de vida útil etc. Ejemplos: el medio de Stuart, el de Cary Blair, etc.
Medios de mantenimiento: son aquellos que permiten la viabilidad y multiplicación de los gérmenes si se mantienen las condiciones óptimas para el desarrollo. Ej: caldo tripticasa-soya más glicerina.
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO.
Disolución del medio de cultivo deshidratado.
Para la preparación de medios de cultivo se utiliza agua limpia, recién destilada o recién desmineralizada y cuya reacción sea la más cercana posible al pH neutro.
Los recipientes destinados a la preparación (por lo general matraces, erlenmeyer) se limpian escrupulosamente con el agua que se ha descrito en el párrafo anterior, con el fin de eliminar totalmente eventuales residuos de otras sustancias. Los recipientes destinados a la preparación de medios de cultivo deben ser lo suficientemente grandes para que el medio de cultivo que se prepara pueda ser agitado con facilidad y concienzudamente. De ser posible, no se prepararán más de 1/2 litro por recipiente. Al medio de cultivo deshidratado y pesado se añade aproximadamente la mitad de la cantidad necesaria de agua y se agita suficientemente para conseguir una suspensión homogénea. Después se incorpora la cantidad de agua restante, aprovechando esta adición para desprender e incorporar al conjunto las partículas de medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a la pared interna del recipiente.
Todo tipo de medio de cultivo es sensible al calentamiento. Por este motivo, no debe calentarse más de lo estrictamente necesario con la intención de facilitar la solubilidad.
Los medios nutritivos que no contienen agar ni gelatina se pueden disolver, por lo general, en agua fría o con un ligero calentamiento. A fin de obtener una preparación adecuada se recomienda hacer uso de estas indicaciones. Los medios nutritivos que contienen agar o gelatina deben ser calentados para conseguir su disolución. Este calentamiento se realiza en baño maría. En el caso de medios de cultivo que no deban ser sometidos a ulterior esterilización en autoclave, es imprescindible prestar atención a su disolución completa. Puede reconocerse que se ha alcanzado este grado cuando, al agitar, no se adhiere a la pared interna del recipiente partícula alguna de agar y la solución viscosa, resbala libremente.
Ajuste del pH.
El valor del pH depende mucho de la composición del medio de cultivo, de la temperatura que tenga este medio de cultivo en el momento de su medición y del tratamiento a que se haya sometido dicho medio de cultivo durante su obtención (disolverlo, esterilizarlo). Por este motivo, la medición del pH se hace después de la esterilización. Para realizar esta medida, lo mejor es utilizar un aparato medidor de pH ("peachímetro") (sin olvidar la compensación de temperatura en el aforo del electrodo).En los medios de cultivo sólidos, la medición del pH (y, eventualmente la corrección que fuese precisa) se realiza a 45-50ºC (medio de cultivo líquido) y en los medios nutritivos líquidos se hace a temperatura ambiente.
El pH se ajusta al valor indicado para cada medio de cultivo. A la temperatura de incubación, el valor del pH quedará dentro de los límites de oscilación previstos. La corrección se logra por adición de solución 1N o 1/10N de ácido clorhídrico o de hidróxido sódico, a una muestra de medio de cultivo exactamente medida (por ejemplo, 50 ml.). La cantidad de solución correctora necesaria para la totalidad del producto preparado se calcula fácilmente a partir de la cantidad de solución correctora empleada para la muestra del medio de cultivo.
Esterilización.
Antes de su esterilización, y dentro de lo posible, es conveniente repartir el medio de cultivo en porciones más pequeñas, por ejemplo, en los recipientes definitivos o en los que ulteriormente se lleve a cabo el trabajo de investigación de que se trate (excepto placas de Petri).
Tras la esterilización y después de haber alcanzado el equilibrio de presiones (entre el interior y el exterior del autoclave) y para evitar la sobrecarga térmica del medio de cultivo, deben sacarse enseguida del autoclave.
Temperaturas más altas y calentamientos más prolongados de lo previsto perjudican la calidad del medio de cultivo. El autoclave es la forma de esterilización más segura para los medios de cultivo. Si no se dispone de autoclave, se puede utilizar una olla de
presión grande de uso en la cocina.
Control de calidad.
Control de esterilidad: ausencia de desarrollo después de una incubación de 18-24 hs a 35 -37 ºC, de algunas muestras tomadas al azar del medio de cultivo.
Control de calidad: cada nueva partida debe ser ensayada selectivamente con organismos de reserva de modo que se puedan observar los resultados esperados, tanto positivos como negativos.
Control de caducidad: verificar en todos los casos que el medio a utilizar no esté vencido observando la etiqueta del envase. Una vez preparado se puede conservar en heladera por un tiempo limitado.
Nota: Los medios de cultivo deben llevar un rótulo que indique claramente contenido y fecha de preparación
BIBLIOGRAFIA.
– LENNETTE, Edwin H. Manual de Microbiología Clínica. Ed. Médica Panamericana.
– BAILEY-SCOTT. Diagnóstico Microbiológico. Ed. Médica Panamericana.
– MAC FADDIN, J.F. Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. Ed. Médica Panamericana.
– KONEMAN, Elmer W. Diagnóstico Microbiológico. Ed. Médica Panamericana.
– Manual Merck. Medios de Cultivo.
– Manual de Procedimientos de Laboratorio y de Productos. BBL.
Aunque las tendencias en microbiología clínica apuntan claramente hacia el desarrollo de métodos rápidos, independientes del crecimiento de los microorganismos, para determinar la presencia de agentes infecciosos, el aislamiento y la identificación de los patógenos viables son aún el “estándar” de oro” para el diagnóstico actual de las enfermedades infecciosas.
Medios artificiales.
El objetivo principal de preparar un medio de cultivo es proporcionar una mezcla equilibrada de todos los nutrientes requeridos, en concentraciones que permitan un buen crecimiento del microorganismo para el cual ha sido diseñado.
Es necesario disponer de una base mineral que proporcione todos los electrolitos en forma iónica, que pueden actuar como nutrientes y/o favorecedores de la actividad enzimática.
Este medio basal debe suplementarse con sustancias orgánicas que actúan como fuente de energía y/o una fuente de carbono más algún factor de crecimiento requerido. Estos suplementos variarán de acuerdo con las propiedades nutricionales particulares del organismo que se desea cultivar.
La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y peptona a la que se añadirán otros ingredientes.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licua completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados.
Estos medios pueden promover el desarrollo de microorganismos solamente si se cumplen ciertos requisitos para el crecimiento, éstos incluyen:
Temperatura de incubación.
Los microorganismos mesófilos crecen en forma óptima entre 20 y 40 ºC. Otros como los psicrófilos lo hacen a temperaturas entre 10 a 20 ºC y en los termófilos la temperatura es de 50 a 60 ºC. En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 35 ºC, y los saprófitos tienen rangos más amplios.
Condiciones adecuadas de humedad.
La presencia de agua en el medio y en la atmósfera es indispensable para el crecimiento bacteriano.
Concentración salina.
La mayoría de los organismos crece bien en medios ordinarios. Otros como las bacterias halófilas requieren altas concentraciones salinas.
pH.
La concentración de iones hidrógenos es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de las bacterias se desarrollan en medios con un pH neutro, aunque las hay que requieren medios más o menos ácidos y otras, alcalinos.
Oxígeno.
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal (aerobios). Los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental y los que son microaerófilos crecen bien si la tensión de oxígeno es inferior a la que precisan los aerobios. Ciertos organismos (p.ej., los meningococos y gonococos), crecen mejor si la PCO2 es algo superior a la del aire (capnófilos). Los anaerobios facultativos son capaces de crecer en condiciones aerobias o anaerobias.
CLASIFICACION DE MEDIOS DE CULTIVO.
Los medios de cultivo en microbiología pueden clasificarse de muchas maneras:
a) Según su estado físico
- líquidos
- sólidos
- semisólidos
b) Por su naturaleza
- naturales
- artificiales o sintéticos
- semisintéticos
c) Por su finalidad metabólica
- mínimos
- diferenciales
- enriquecidos
- selectivos
- de enriquecimiento
d) Por su uso
- pruebas bioquímicas
- recuento de bacterias
- especiales
- transporte
- medios de mantenimiento
a) Según su estado físico.
Medios líquidos: permiten el crecimiento libre de los microorganismos con distribución y características que dependerán del germen o de las necesidades del usuario, de que sea estático o esté agitado permanentemente y de su relación con la fase gaseosa (oxígeno en general) u otra.
Medios sólidos: (Agar -agarosa) permiten el crecimiento de los microorganismos en el interior o en la superficie sólida o semisólida del medio que contacta directamente con la fase gaseosa. Los medios sólidos tienen de 1,5% a 2% de agar, en tanto los semisólidos tienen de 0,3 a 0,5% de agar.
b) Por su naturaleza.
Medios naturales: son aquellos en los que todos sus componentes son sustancias biológicas de las cuales no se conoce su composición cuali ni cuantitativa.
Medios sintéticos: son aquellos de composición química conocida definida cuali y cuantitativamente.
Medios semisintéticos; son medios que contienen sustancias químicas en proporciones conocidas junto a productos de origen natural. Ej agar sangre, agar nutritivo, etc.
c) Por su finalidad metabólica.
Medios mínimos: son aquellos que presentan en su composición la base mínima de nutrientes capaz de permitir el desarrollo de microorganismos.
Son de uso frecuente para el cultivo de microorganismos poco exigentes, también sirven de base para otros medios. Su composición es muy simple: contienen cloruro de sodio, extractos de carne (fuente de vitaminas y coenzimas), peptona (proteínas parcialmente hidrolizadas) y agua. Sirven para el desarrollo, aislamiento y conservación de microorganismos. Ejemplos: Caldo nutritivo (CN), Agar nutritivo (AN),
Agar tripteína-soya (ATS).
Medios diferenciales e indicadores: son aquellos que permiten determinar características metabólicas o marcadores genéticos de microorganismos, sin inhibir sus funciones fisiológicas. En estos se incluyen diversos colorantes e indicadores de pH y otros componentes, que actúan como indicadores de las actividades enzimáticas y ayudan a identificar las bacterias aisladas. Estos medios no contienen sustancias inhibitorias.
Ejemplo: Agar-Cistina Lactosa Deficiente en Electrolitos_(CLDE): Permite la diferenciación de bacterias fermentadoras de lactosa de las no fermentadoras. La degradación del hidrato de carbono a ácido origina un viraje de color hacia el amarillo del Azul de Bromotimol. La alcalinización provoca un viraje a azul intenso.
Desarrollan Enterobacterias, Pseudomonas, Enterococos y Estafilococos.
Medios enriquecidos: son aquellos que por el agregado de algunos componentes como sangre, suero, extractos de tejidos vegetales o animales al CN, AN, ATS, proveen al medio de nutrientes adicionales, que permiten el desarrollo de bacterias exigentes. Ejemplos
Agar Sangre: para su preparación se agrega sangre al 5% a un volumen de agar base
estéril, fundido y enfriado a 50 ºC. Es adecuado para el cultivo de Neumococos, Estreptococos y otras bacterias exigentes. Es además un medio de cultivo diferencial porque pone de manifiesto la acción de una hemolisina bacteriana que permite diferenciar especies hemolíticas de otras no hemolíticas. En las primeras se observa alrededor de las colonias la formación de dos tipos de halos:
Uno transparente que denota una hemólisis total, que corresponde a las especies beta hemolíticas (Ejemplo: Estreptococos de grupo A, algunos del grupo D, etc.).
Un halo de coloración verdosa o hemólisis parcial, que corresponde a las especies alfa hemolíticas (Ejemplo: Neumococos, Estreptococos no grupo A, etc.).
A las especies no hemolíticas se las suele denominar gama hemolíticas o anhemolíticas.
En agar sangre se puede observar el clásico fenómeno de satelitismo:
En el ser humano, Haemophilus influenzae es el agente etiológico más común de meningitis bacteriana aguda en los niños. La mayoría de las especies de Haemophilus requieren para su desarrollo ciertos factores de crecimiento como el factor X (hemina) y el factor V (NAD ó NADP). El factor X es empleado por los microorganismos para elaborar citocromo y otros pigmentos respiratorios aeróbicos. El factor V actúa como receptor intermediario de hidrógeno en los mecanismos respiratorios. Casi todas las bacterias son capaces de sintetizar ambos factores, excepto algunas como Haemophilus. influenzae que no sintetizan el factor V.
El agar chocolate (que se describe a continuación) proporciona estos factores (X y V) necesarios para el crecimiento de estas especies de Haemophilus. El agar sangre tiene solamente el factor X (hemina), por lo tanto, para el crecimiento del Haemophilus influenzae es necesario el agregado del factor V.
Diversas bacterias, como el estafilococo, elaboran el factor V (NAD) como producto de su metabolismo. Si la muestra de la que se pretende aislar Haemophilus influenzae se inocula por estrías sobre una placa de agar sangre y luego con un ansa se realiza una única estría de un estafilococo hemolítico productor de factor V, atravesando el área donde se ha sembrado la muestra, luego de 18 a 24 horas de incubación, es posible observar las diminutas colonias de Haemophilus como gotas de rocío alrededor de las colonias hemolíticas de Estafilococos. Éste es el fenómeno conocido como “satelitismo”.
Agar Chocolate: en su preparación se agrega sangre al 5% a un volumen de agar base estéril, fundido y enfriado a 50 ºC, la cual se calienta luego a 80ºC, agitando (evitar espuma) hasta que aparece un color marrón. Con este calentamiento se han lisado los glóbulos rojos y liberados los dos factores: el factor X (hemina) y el factor V (NAD o NADP). El agar chocolate es un medio enriquecido ideal para el aislamiento de Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis.
Se debe tener presente que algunos medios base son considerados medios enriquecidos sin ningún otro agregado, debido al alto contenido de nutrientes que poseen. Ejemplo: Caldo Infusión Cerebro-Corazón (ICC).
Medios selectivos: si los requerimientos de un microorganismo son conocidos es posible desarrollar un conjunto de condiciones en las que su crecimiento específico sea favorecido y el de otros impedidos, permitiendo su aislamiento a partir de poblaciones mixtas aún cuando esté en menor proporción.
La adición de ciertas sustancias químicas al medio de cultivo, impide el desarrollo de algunas bacterias sin inhibir otras. Estos agentes selectivos son muy útiles para evidenciar la presencia de patógenos específicos en una muestra que contiene flora mixta, y para su posterior identificación.
Son utilizados como agentes selectivos: los colorantes: ejemplo: cristal violeta que inhibe bacterias Gram (+), verde brillante utilizado en medios altamente selectivos para
eliminar la flora acompañante, Gram (+) y Gram (-). El cloruro de sodio en altas concentraciones inhibe a casi todas las bacterias excepto las halófilas.
Otros agentes selectivos son: citrato de sodio, selenito de sodio, sales biliares (desoxicolato de sodio), etc.
También puede hacerse selectivo un medio ajustando la reacción a un pH muy elevado o muy bajo. Ej: pH 5,6 en el medio de Sabouraud (para hongos); pH 8,0-9,0 para el aislamiento de Vibrio cholerae.
Otro grupo de agentes selectivos son los antimicrobianos: vancomicina, trimetoprima, colistina, etc.
Los agentes reductores también se adicionan a los medios para hacerlos selectivos y promover el desarrollo de microorganismos anaerobios. Ejemplo: ácido ascórbico, tioglicolato de sodio, cisteína, etc.
Dentro de los medios selectivos hay variación en cuanto a su poder inhibitorio; altamente selectivo, medianamente selectivo y ligeramente selectivo, etc.
Agar EMB (agar eosina-azul de metileno): es ligeramente selectivo y utilizado para el aislamiento de bacilos entéricos. Permite también la diferenciación de Escherichia coli, Enterobacter y otros microorganismos.
Los colorantes contenidos en su fórmula inhiben a muchos microorganismos acompañantes Gram (+). El medio contiene también lactosa que es degradada por las bacterias coliformes, el ácido producido por la degradación de este azúcar y la mezcla de los colorantes eosina y azul de metileno, produce el cambio de color de los mismos y su precipitación, tiñendo las colonias. Las de E. coli, lactosa (+), aparecen negro-verdosas con brillo metálico; las de Enterobacter spp, lactosa (+) con centro violeta o pardo oscuro y periferia violeta pálido sin brillo metálico. Salmonella spp y Shigella spp, que son lactosa (-), desarrollan colonias transparentes, ámbar hasta incoloras.
Agar Mc Conkey: es similar al anterior en su poder inhibitorio y contiene una mezcla de sales biliares y cristal violeta que inhibe a microorganismos Gram (+); lactosa y rojo neutro como indicador de pH. El aumento de la acidez del medio por la acción fermentadora de las bacterias lactosa (+) produce una coloración roja en sus colonias; las bacterias no fermentadoras, lactosa (-), colonias incoloras.
Agar SS: es un medio más selectivo, utilizado para el aislamiento de Salmonella y Shigella a partir de heces, alimentos, etc. El verde brillante, las sales biliares y una elevada concentración de tiosulfato y citrato, inhiben considerablemente a la flora acompañante. Con el tiosulfato y los iones férricos se pone de manifiesto la formación de sulfuro de hidrógeno por el ennegrecimiento de las colonias, al precipitar el sulfuro de hierro. La presencia de lactosa permite diferenciar colonias rojas en las bacterias L(+), y colonias incoloras en las L(-).
Agar Manitol Salado: es utilizado para la demostración de estafilococos patógenos. La concentración extremadamente alta de cloruro de sodio (7,5%), permite el crecimiento de microorganismos tolerantes a la misma, entre los que se encuentran los del género Staphylococcus.
También contiene manitol, cuya degradación lleva a la formación de ácidos, está notablemente correlacionada con la patogenicidad y sirve para detectar la presencia de Staphylococcus aureus. La acidez produce en el medio un cambio de color (de rojo a amarillo), por viraje del indicador rojo fenol. Las colonias de S. aureus tienen un crecimiento intenso, con formación de un halo amarillo luminoso por ser organismos
manitol (+). S. epidermidis tiene un crecimiento débil casi siempre y no produce
cambio de color manitol (-).
Agar Thayer Martin: con el agregado de una mezcla liofilizada de vancomicina, colistin, trimetroprima y nistatina, más aditivos estimulantes del crecimiento, es un medio ideal para el aislamiento selectivo de gonococos y meningococos, porque inhibe la flora acompañante incluida las Neisseria saprófitas. Es un medio altamente selectivo.
Medios De Enriquecimiento: generalmente son caldos, destinados a promover el crecimiento de los microorganismos presentes. Ejemplo: CN.
Se debe tener en cuenta que los caldos también pueden clasificarse en selectivos, diferenciales, enriquecidos, etc, conforme al agregado de diferentes sustancias.
Caldos Selectivos de enriquecimiento: contienen agentes inhibidores; favorecen especialmente el crecimiento de microorganismos patógenos, que generalmente se encuentran en escaso número en las muestras. Ej: Caldo Selenito para el enriquecimiento selectivo de Salmonella y eventualmente Shigella, a partir de heces, orina, agua, alimentos, etc. El selenito inhibe el crecimiento de bacterias intestinales coliformes y enterococos, principalmente en las primeras seis horas de incubación y hasta 12 horas. Proteus y Pseudomonas no son inhibidos.
Caldos enriquecidos: el agregado de diferentes sustancias no inhibidoras como por ejemplo sangre al 5% a un caldo nutritivo transforma al medio de enriquecimiento en enriquecido.
Caldos Diferenciales: son aquellos usados para identificación bacteriana, por ejemplo los caldos de fermentación de H. de C., éstos están compuestos básicamente por un caldo nutritivo, al cual se le agrega un H. de C. (lactosa, glucosa, etc) y un indicador de pH. El cambio de color del medio base, indicará la capacidad del germen de utilizar el H. de C.
d) Por su uso.
Medios para pruebas bioquímicas: utilizados para la determinación de ciertas propiedades bioquímicas de los microorganismos que junto a otras características o marcadores genéticos, permiten su identificación (investigación de la degradación de azúcares, metabolismo proteico, metabolismo lipídico). Ej: citrato de Simmons, Agar fenilalanina.
Medios para recuentos de bacterias: se emplean para la determinación del número de bacterias contenidas en materiales tales como el agua, leche, productos lácticos. Ej: Plate Count Agar (PCA), en orina el Agar CLDE.
Medios especiales: son aquellos cuya fórmula constitutiva cumple las exigencias vitales de un determinado germen que sólo en ese medio halla las condiciones óptimas de desarrollo; ejemplo: medio Lowenstein-Jensen para micobacterias.
Medios de transporte: pueden ser líquidos o semisólidos. Mantienen viables los microorganismos durante un tiempo variable y son utilizados para la remisión de las muestras al laboratorio.
Cada uno de ellos trae especificaciones en cuanto a su preparación, tiempo de vida útil etc. Ejemplos: el medio de Stuart, el de Cary Blair, etc.
Medios de mantenimiento: son aquellos que permiten la viabilidad y multiplicación de los gérmenes si se mantienen las condiciones óptimas para el desarrollo. Ej: caldo tripticasa-soya más glicerina.
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO.
Disolución del medio de cultivo deshidratado.
Para la preparación de medios de cultivo se utiliza agua limpia, recién destilada o recién desmineralizada y cuya reacción sea la más cercana posible al pH neutro.
Los recipientes destinados a la preparación (por lo general matraces, erlenmeyer) se limpian escrupulosamente con el agua que se ha descrito en el párrafo anterior, con el fin de eliminar totalmente eventuales residuos de otras sustancias. Los recipientes destinados a la preparación de medios de cultivo deben ser lo suficientemente grandes para que el medio de cultivo que se prepara pueda ser agitado con facilidad y concienzudamente. De ser posible, no se prepararán más de 1/2 litro por recipiente. Al medio de cultivo deshidratado y pesado se añade aproximadamente la mitad de la cantidad necesaria de agua y se agita suficientemente para conseguir una suspensión homogénea. Después se incorpora la cantidad de agua restante, aprovechando esta adición para desprender e incorporar al conjunto las partículas de medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a la pared interna del recipiente.
Todo tipo de medio de cultivo es sensible al calentamiento. Por este motivo, no debe calentarse más de lo estrictamente necesario con la intención de facilitar la solubilidad.
Los medios nutritivos que no contienen agar ni gelatina se pueden disolver, por lo general, en agua fría o con un ligero calentamiento. A fin de obtener una preparación adecuada se recomienda hacer uso de estas indicaciones. Los medios nutritivos que contienen agar o gelatina deben ser calentados para conseguir su disolución. Este calentamiento se realiza en baño maría. En el caso de medios de cultivo que no deban ser sometidos a ulterior esterilización en autoclave, es imprescindible prestar atención a su disolución completa. Puede reconocerse que se ha alcanzado este grado cuando, al agitar, no se adhiere a la pared interna del recipiente partícula alguna de agar y la solución viscosa, resbala libremente.
Ajuste del pH.
El valor del pH depende mucho de la composición del medio de cultivo, de la temperatura que tenga este medio de cultivo en el momento de su medición y del tratamiento a que se haya sometido dicho medio de cultivo durante su obtención (disolverlo, esterilizarlo). Por este motivo, la medición del pH se hace después de la esterilización. Para realizar esta medida, lo mejor es utilizar un aparato medidor de pH ("peachímetro") (sin olvidar la compensación de temperatura en el aforo del electrodo).En los medios de cultivo sólidos, la medición del pH (y, eventualmente la corrección que fuese precisa) se realiza a 45-50ºC (medio de cultivo líquido) y en los medios nutritivos líquidos se hace a temperatura ambiente.
El pH se ajusta al valor indicado para cada medio de cultivo. A la temperatura de incubación, el valor del pH quedará dentro de los límites de oscilación previstos. La corrección se logra por adición de solución 1N o 1/10N de ácido clorhídrico o de hidróxido sódico, a una muestra de medio de cultivo exactamente medida (por ejemplo, 50 ml.). La cantidad de solución correctora necesaria para la totalidad del producto preparado se calcula fácilmente a partir de la cantidad de solución correctora empleada para la muestra del medio de cultivo.
Esterilización.
Antes de su esterilización, y dentro de lo posible, es conveniente repartir el medio de cultivo en porciones más pequeñas, por ejemplo, en los recipientes definitivos o en los que ulteriormente se lleve a cabo el trabajo de investigación de que se trate (excepto placas de Petri).
Tras la esterilización y después de haber alcanzado el equilibrio de presiones (entre el interior y el exterior del autoclave) y para evitar la sobrecarga térmica del medio de cultivo, deben sacarse enseguida del autoclave.
Temperaturas más altas y calentamientos más prolongados de lo previsto perjudican la calidad del medio de cultivo. El autoclave es la forma de esterilización más segura para los medios de cultivo. Si no se dispone de autoclave, se puede utilizar una olla de
presión grande de uso en la cocina.
Control de calidad.
Control de esterilidad: ausencia de desarrollo después de una incubación de 18-24 hs a 35 -37 ºC, de algunas muestras tomadas al azar del medio de cultivo.
Control de calidad: cada nueva partida debe ser ensayada selectivamente con organismos de reserva de modo que se puedan observar los resultados esperados, tanto positivos como negativos.
Control de caducidad: verificar en todos los casos que el medio a utilizar no esté vencido observando la etiqueta del envase. Una vez preparado se puede conservar en heladera por un tiempo limitado.
Nota: Los medios de cultivo deben llevar un rótulo que indique claramente contenido y fecha de preparación
BIBLIOGRAFIA.
– LENNETTE, Edwin H. Manual de Microbiología Clínica. Ed. Médica Panamericana.
– BAILEY-SCOTT. Diagnóstico Microbiológico. Ed. Médica Panamericana.
– MAC FADDIN, J.F. Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. Ed. Médica Panamericana.
– KONEMAN, Elmer W. Diagnóstico Microbiológico. Ed. Médica Panamericana.
– Manual Merck. Medios de Cultivo.
– Manual de Procedimientos de Laboratorio y de Productos. BBL.
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